Антитіла молока і сироватки крові людини характеристика каталітичної активності та вплив на ріст і виживання клітин

Сторінка 10

Про можливе існування цих ділянок у sIgA-абзимів свідчать результати аналізу спорідненості щодо олігонуклеотидів і АТР електрофоретично гомогенних препаратів sIgA, отриманих із молока людини послідовними хроматографіями на протеїн А-сефарозі і ДЕАЕ-фрактогелі (рис.9). Очищені у такий спосіб sIgA слугували основою для подальшої очистки АТ, які володіють фосфотрансферазною і нуклеазною активністю.

За допомогою афінної модифікації sIgA-антитіл 32Р-міченими алкілуючими похідними олігонуклеотидів і АТР у присутності конкурентів (dT14 і АТР) встановлено, що секреторний компонент sIgA виявляє спорідненість до дезоксирибоолігонуклеотидів (рис.9, доріжки 3, 4), тоді як важкі і легкі ланцюги цих антитіл, головним чином, зв'язуються із АТР (рис.9, доріжки 5, 6).

На основі цього аналізу було зроблено припущення про те, що подібно до інгібувальної дії АТР на нуклеазну активність sIgA-абзимів, олігонуклеотиди можуть бути залучені до регуляції протеїнкіназної активності sIgA-абзимів молозива породіль. Підтвердженням цього припущення слугувало дослідження впливу олігонуклеотидів на протеїнкіназну активністю анти-ДНК sIgA молозива породіль.

Протеїнкіназна активність анти-ДНК sIgA молока людини. При інкубації sIgA, очищених на ДНК-целюлозі, із [-32P] ATP було виявлено включення радіоактивного фосфату у поліпептиди цих імуноглобулінів (рис.10А, доріжка 1), що свідчить про можливу протеїнкіназну активність анти-ДНК sIgA-антитіл. Незначний рівень протеїнкіназої активності цих АТ спостерігали, коли субстратом фосфорилювання слугував казеїн молока людини (рис.10Б, доріжка 6). Отримані результати показали, що подібно до sIgA-антитіл, очищених із молока людини хроматографією на АТР-сефарозі (Kit et al., 1996), анти-ДНК sIgA також можуть володіти протеїнкіназною активністю. У присутності мікромолярних кількостей дезоксирибоолігонуклеотиду d(A) 12 спостерігається значне зростання фосфорилювання важких ланцюгів sIgA (рис.10А, доріжки 5-8) і казеїну (рис.10Б, доріжки 1-5). При цьому рибоолігонуклеотид r(A) 12 помітно не впливав на протеїнкіназну активність цих антитіл (рис.10Б, доріжки 7-11). Таким чином, нами було з'ясовано, що sIgA, очищені із молока людини афінною хроматографією на ДНК-целюлозі, крім нуклеотид-залежної нуклеазної активності, також володіють олігонуклеотид-залежною протеїнкіназною активністю.

Цитотоксична активність анти-ДНК sIgA молока людини клітин ссавців in vitro. Важливою властивістю анти-ДНК АТ, виділених із сироватки крові хворих на СЧВ і розсіяний склероз, є їхня здатність індукувати загибель клітин шляхом апоптозу (Kozyr et al., 2000; Nevinsky et al., 2002). Подібну цитотоксичну активність також було виявлено в анти-ДНК IgG, очищених із молока клінічно здорових жінок (Nevinsky et al., 2002).

Аналіз спорідненості FITC-мічених sIgA, очищених на ДНК-целюлозі, виявив їхню здатність зв'язуватися із фіксованими Т-клітинами лінії Jurkat (рис.11). Розподіл флуоресцентної мітки показав, що мішенню дії анти-ДНК sIgA можуть бути структури, локалізовані на плазматичній мембрані, або в цитоплазмі цих клітин (рис.11, картинки 1, 3). Це дозволило припустити, що анти-ДНК sIgA можуть впливати на ріст і виживання клітин.

Ми вивчили дію препаратів анти-ДНК sIgA молозива породіль на життєздатність трансформованих фібробластів лінії L929 миші, клітин лейкемії людини (лінії Namalwa, Jurkat) та клітин лінії L1210 лейкемії миші. Вплив АТ на ріст і виживання клітин in vitro визначали за індексом життєздатності (ІЖ), який вираховували за формулою, наведеною у розділі “Матеріали і методи досліджень”. Аналіз отриманих даних свідчить про те, що використані нами лінії клітин суттєво відрізняються між собою за чутливістю до дії препаратів анти-ДНК sIgA (рис.12). Найбільш чутливими були фібробласти лінії L929 (ІЖ ? 20). Значно меншою цитотоксичною дією ці імуноглобуліни володіли щодо T-клітин ліній Jurkat (ІЖ ? 40) та В-клітин лінії L1210 (ІЖ ? 30). В-клітини лінії Namalwa були найменш чутливими до дії анти-ДНК sIgA (ІЖ ? 60).

На підставі отриманих даних можна зробити висновок, що препарати sIgA зі спорідненістю до ДНК тимусу теляти, які містять абзими з нуклеазною і фосфотрансферазною активністю, можуть із різною ефективністю індукувати загибель ракових та трансформованих клітин in vitro. Доведено, що цитотоксична дія анти-ДНК IgG сироватки крові хворих на системний червоний вовчак і на розсіяний склероз безпосередньо пов'язана із їхньою ДНКазною активністю АТ (Kozyr et al., 2002). Тому можна припустити, що загибель клітин під дією анти-ДНК sIgA молозива людини відбувається за подібним механізмом.